Molekulare und zelluläre Charakterisierung der Bedeutung von Zelltodprozessen für den Wirtszellaustritt und Zell-zu-Zell-Transfer von Leishmania

Um als Parasitenpopulation zu überleben und sich zu vermehren, durchlaufen L. major Amastigoten Zyklen der Infektion, der intrazellulären Vermehrung, des Austritts aus der Wirtszelle und des Eintritts in neue Wirtszellen. Durch die Kombination von Lebendzellmikroskopie menschlicher Makrophagen in vitro, durchflusszytometrischer Quantifizierung des Exit-Prozesses und intravitaler 2-Photonen-Bildgebung der Infektionsstelle im Mausmodell sollen Mechanismen identifiziert werden, die diesem grundlegenden Prozess zugrunde liegen, der für die Persistenz, Ausbreitung und Pathogenese von Leishmanien entscheidend ist.

Unter Verwendung eines genetisch kodierten Proliferationsreportersystems und wachstumsgehemmter KBMA-Erreger fanden wir in der ersten Förderperiode des SPP heraus, dass der Austritt von Leishmanien sowohl in vivo als auch in vitro durch den Proliferationszustand des Parasiten beeinflusst wird. Stark proliferierende Amastigoten sind die vorherrschende Form, die am Exit beteiligt ist, und pro-inflammatorische Makrophagen wurden als bevorzugte Nische für stark erhöhte Proliferation gefunden. Die Beteiligung der Apoptose in menschlichen Makrophagen in vitro und im Mausgewebe in vivo wurde nachgewiesen, wobei der Exit meist im Zusammenhang mit dem Transfer von Zellmaterial aus der ursprünglich infizierten Zelle beobachtet wurde. Dies deutet auf einen direkten Transfer von Zelle zu Zelle hin, mit nur minimaler Exposition gegenüber dem extrazellulären Milieu. Neben der Apoptose könnte auch die Pyroptose zu diesem Prozess beitragen. Darüber hinaus fanden wir Hinweise darauf, dass die Leishmanienproliferation den Stoffwechsel der Wirtszellen moduliert, z. B. durch die Expression des Lipidrezeptors CD36, was sich sowohl auf den Tod der Wirtszellen als auch auf die Efferozytose durch andere Zellen auswirken könnte.

Mit Hilfe der BLaER1-Zelllinie und zelltodspezifischen Knockouts von Caspase-3 und Gasdermin D wollen wir nun die Beteiligung von Apoptose und Pyroptose am Pathogen-Exit auf molekularer Ebene aufklären. Diese Experimente werden durch die Hemmung von Caspase-3 und Gasdermin D defizienten Wirtszellen im Mausmodell ergänzt.
Mit Hilfe des Proliferationsreporters und des KBMA-Systems wollen wir die Phänotypen der Wirtszellen untersuchen, die einen effizienten Austritt von Amastigoten unterstützen. Dies wird eine FACS-Anreicherung und anschließende massenspektrometrische Analysen sowie eine funktionelle und korrelative Bildgebung des Austrittsmechanismus im Detail ermöglichen. Um schließlich die metabolischen Veränderungen zu untersuchen, die für einen produktiven Zell-zu-Zell-Transfer erforderlich sind, werden wir den Lipidstoffwechsel der Wirtszellen charakterisieren und die Auswirkungen eines CD36-Mangels sowohl auf den Erregeraustritt als auch auf die Aufnahme des Erregers durch neue Wirtszellen untersuchen.

In order to survive and replicate as a parasite population, L. major amastigotes have to undergo cycles of infection, intracellular proliferation, host cell exit and entry into new host cells. By the combination of both in vitro human live cell imaging, flow cytometry quantification of the exit process and intravital 2-photon imaging of the infection site in the mouse model, we aim to identify mechanisms underlying this fundamental process crucial for Leishmania persistence, propagation and pathogenesis.

Using a genetically encoded proliferation reporter system and growth-inhibited KBMA pathogens, we found in the first funding period of the SPP that Leishmania exit, both in vivo and in vitro, is triggered by the parasite’s proliferation state. Highly proliferating amastigotes are the predominating form involved in exit and pro-inflammatory macrophages were found as the preferred niche for strongly increased proliferation. Involvement of apoptosis in human macrophages in vitro and in the mouse tissue in vivo was demonstrated, whereby exit was mostly observed in the context of cell material transfer from the initially infected cell. This suggests a direct cell-to-cell transfer with only minimal exposure to the extracellular milieu. Also, pyroptosis, in addition to apoptosis, might contribute to the process. Furthermore, we found evidence that Leishmania proliferation modulates the host cell metabolism such as expression of the lipid receptor CD36, which might impact both on host cell death, as well as on efferocytosis by other cells.

We now aim to elucidate the involvement of both apoptosis and pyroptosis in pathogen exit on a molecular level by using the BLaER1 cell line and cell death-specific caspase-3 and Gasdermin D knockouts. These experiments will be complemented using caspase-3 inhibition and Gasdermin D deficient host cells in the mouse model.
Using both the proliferation reporter and KBMA systems, we want to dissect the host cell phenotypes supporting efficient exit of amastigotes, which will enable FACS sorting enrichment and consequent mass spectrometry analyses as well as functional and correlative imaging of the exit mechanism in more detail. Finally, to investigate the metabolic changes required for a productive cell-to-cell transfer, we will characterize host cell lipid metabolism and address the impact of CD36 deficiency both for pathogen exit as well as for pathogen uptake by new host cells.