Real Time Monitoring of MR-Protein Interacitons in Living Cells: Establishing of an eBRET System

Der Mineralokortikoidrezeptor (MR) ist ein Steroidrezeptor, der an der Regulation des  Wasser-Elektrolythaushaltes wesentlich beteiligt ist und klassischerweise nach Stimulation mit dem endogenen Liganden Aldosteron als Homodimer an DNA bindet und dort als Transkriptionsfaktor agiert. Neuere Untersuchungen weisen ihm zusätzlich eine Bedeutung bei  pathophysiologischen Veränderungen im Herzkreislaufsystem und den Nieren zu, wobei der zugrunde liegende Mechanismus noch unklar ist. Es gibt allerdings erste Hinweise, dass zytoplasmatische Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle für die pathologischen MR-Effekte spielen. Um dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen MR und anderen Proteinen in Echtzeit und in lebenden Zellen messen zu können, haben wir ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren  (eBRET) für die Langzeitmessung von MR-Protein-Wechselwirkungen etabliert und es anhand der MR Homodimerbildung getestet.  Hierfür werden Fusionsproteine aus MR und Renilla Luciferase bzw. MR und EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) in HEK-Zellen exprimiert. Nach Zugabe des Renilla-Luciferase-Substrats EndurenÒ entsteht Biolumineszenz, die bei Homodimerbildung zwischen MR-Renilla-Luciferase und EYFP-MR zu einem Energietransfer mit  Anregung des fluoreszierenden EYFP führt. Das emittierte Licht des EYFP-MR kann quantifiziert werden und ermöglicht es die Interaktion der Proteine in Echtzeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Mit Hilfe des eBRET-Systems sollen in Zukunft die den physiologischen und pathologischen MR-Effekten zugrunde liegenden Protein-Protein-Wechselwirkungen weiter erforscht werden.