Etablierung und Analyse eines LGR5 und LGR5∆5 Tumorstammzellmodels nach CRISPR/Cas9 knock down an zwei humanen Zelllinien

Der Stammzellmarker und Zelloberflächenrezeptor LGR5 spielt eine bedeutende Rolle für die Selbsterneuerung von adulten Stammzellen und ist ein Aktivator des Wnt-Signalweges. Die Stammzelltheorie der Tumorentwicklung geht davon aus, dass veränderte Stammzellen die Tumorentwicklung initiieren und letztlich die Tumorprogression maßgeblich mit verantworten. LGR5 wird in vielen Tumoren überexprimiert sowie als prognoseassoziiert beschrieben.
Die in unserer Arbeitsgruppe erstmals beschriebene Variante des LGR5, das sogenannte LGR5 5, wurde von uns für Patienten mit Weichteilsarkom bzw. Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle als prognoseassoziiert identifiziert (Rot et al., 2011; Rot et al., 2019). Ferner wurde ein signifikant erhöhter LGR5 5 mRNA-Spiegel in solchen Primärtumoren nachgewiesen, bei denen im Krankheitsverlauf regionale Lymphknotenmetastasen auftraten. Dies lässt einen Zusammenhang der Expression von LGR5 5 und der Metastasierung dieser Tumoren als möglich erscheinen (Rot et al., 2019). Eine genaue Charakterisierung der Bedeutung und tumorbiologischen Funktion des LGR5 5 ist notwendig, um diese Hypothese zu untersuchen. Die Mehrheit der bisherigen Publikationen untersuchte meist die Rolle von LGR5 full-length in menschlichen Karzinomen/Sarkomen, nicht jedoch die Varianten des LGR5, etwa LGR5 5.
Eine Interaktion des Oberflächenrezeptors LGR5 mit dem verwandten Rezeptor LGR4 wird vermutet und ähnelt wahrscheinlich der bekannten Wechselwirkung der beiden tumor-assoziierten Rezeptoren EGFR und Her2. Demnach erscheint es dem Antragsteller als notwendig, beide Gene, LGR5 und LGR4, in diesen Untersuchungen zu berücksichtigen, um eine vollständige Beschreibung der Funktion von LGR5 bzw. LGR5 5, unter Beachtung der Rolle von LGR4, erarbeiten zu können.
Für zwei humane Zelllinien sollen mittels einer erst 2012 entwickelten Technologie (CRISPR/Cas9 ("Genschere")), welches es ermöglicht Gene abzuschalten, LGR4 und LGR5 knock out Zellen generiert werden (Rot & Kappler, 2021).
In diesem Studienmodell soll das Gen LGR5 und die Variante LGR5 5 in humanen Zelllinien untersucht sowie die Wechselwirkung mit LGR4 und deren tumorbiologische Auswirkungen auf das Wachstum und die Migration von Tumorzellen analysiert werden.
Hierfür soll LGR5 bzw. LGR5 5 nach einem knock out mittels lentiviraler Transduktion wiederhergestellt und funktionell charakterisiert werden. Es soll das klonogene Langzeitüberleben von LGR4 und LGR5 knock out-Zelllinienklonen mit und ohne Wiederherstellung von LGR5 bzw. LGR5 5 untersucht werden sowie die Fähigkeit der Zellen zu wachsen und zu migrieren. Das Internalisierungsverhalten beider LGR5-Varianten soll analysiert werden sowie die Signaltransduktionswege und involvierten Gene, welche mittels deep sequenzing Analyse identifiziert werden können. Mittels dieser Experimente soll die biologische Funktion von LGR5 5 sowie LGR5 full-length aufgeklärt und die scheinbar unterschiedliche Bedeutung beider Varianten für die Tumorstammzellbiologie von Tumorerkrankungen aufgedeckt werden. Insbesondere soll abschließend festgestellt werden, ob die Variante LGR5 5 für die Progression und Metastasierung von Tumorerkrankungen, insbesondere des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle, verantwortlich ist.
Als Hypothese dieser Studie wird vermutet, dass LGR5 5 für die Progression und Metastasierung von Tumorerkrankungen, insbesondere des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle, verantwortlich ist. Diese Hypothese soll mit diesem Antrag beantwortet werden.