Cryo-electron microscopy studies of native cell extracts - Elucidating an active pyruvate dehydrogenase complex from Chaetomium thermophilum

Summary:
Background: Throughout human history, the search for the secrets of life and the intricacies of biological matter has been a continuous journey. This relentless pursuit, which began with the exploration of the natural world, gradually led us to explore the molecular basis of life and seek answers to questions beyond our understanding. Over the centuries, the development of increasingly advanced tools and technologies has facilitated our exploration of the intricate micro-processes that underlie life itself. One such breakthrough technology is cryo-electron microscopy (cryo-EM), which offers unparalleled insights into the architecture of biological processes. While early cryo-EM studies were limited to purified biomolecules or in situ studies with limited resolution, recent advances have expanded the capabilities of cryo-EM to study large, flexible and heterogeneous complexes in native cell extracts.
Preliminary work: The emerging field of native cell extract studies holds enormous potential for deciphering the high-resolution molecular signatures of complex biological systems. A notable achievement in this field is the structural elucidation of eukaryotic fatty acid synthase (FAS) from native cell extracts, achieving a remarkable resolution of 4.7 Å. These studies not only revealed structural details, but also uncovered previously unknown biomolecular interactions and protein communities that shed light on comprehensive molecular function.
Objective: The main objective of this research project is to build on these achievements by using a systematic approach to study megadalton complexes involved in pyruvate oxidation, a fundamental metabolic process. The project focuses on the pyruvate dehydrogenase complex (PDHc), a key assembly responsible for the conversion of pyruvate to acetyl-CoA, thus bridging the gap between glycolysis and the citric acid cycle. Despite the extensive characterisation of its isolated components, the quaternary structure of PDHc remains a mystery. This project aims to identify and characterise fully assembled Chaetomium thermophilum α-keto acid dehydrogenase complexes in native cell extracts, providing insights into their domain arrangements and functional activities. In addition, the project aims to elucidate the structure of the PDHc core by cryo-EM to discover previously unknown features.
Methods: This research project uses a multidisciplinary approach that combines advanced techniques such as mass spectrometry, activity assays, cross-linking, electron microscopy and computational modelling to comprehensively characterise the PDHc complexes. Cryo-EM is the cornerstone for determining the structure of the PDHc core, providing unprecedented insights into its spatial organisation and the minimal reaction pathway between individual enzymes. This holistic perspective elucidates a dynamic compartment responsible for pyruvate oxidation orchestrated by core and peripheral protein species.
Implications: The results of this research project are of immense importance for scientific progress, particularly in understanding the structure and function of the PDHc and α-keto acid dehydrogenase complexes. By directly studying these large active complexes from native cell extracts, commonly referred to as metabolons, this research illustrates the potential for a holistic approach to deciphering cellular function. Furthermore, this project sets the stage for further integration of proteomics, network biology, biophysical modelling and machine learning that will provide a multi-scale molecular description of protein communities in native cell extracts. This integrated approach promises to significantly improve our understanding of cellular function at the biophysical level.
Alignment with the Sustainable Development Goals (SDGs): This research project is aligned with a number of Sustainable Development Goals (SDGs), including but not limited to:
SDG 3 (Good Health and Wellbeing): By deepening our understanding of fundamental cellular processes, this research can potentially contribute to medical advances and improve global health.
SDG 4 (Quality Education): This research promotes high-quality teaching and research and thus the quality of education and the exchange of knowledge within the scientific community.
SDG 7 (Affordable and Clean Energy): Through its multidisciplinary approach and innovative methods, this research contributes to the efficient use of energy and resources in science.
SDG 8 (Decent work and economic growth): Advances in science and technology promote economic growth and job creation, contributing to decent work.
SDG 9 (Industry, Innovation and Infrastructure): The development and application of cutting-edge technologies and methods, as demonstrated in this research, can play an important role in promoting innovation and industry.
SDG 13 (climate policy): By improving our understanding of cellular processes and enabling more efficient scientific research, this project indirectly supports climate change mitigation efforts by reducing resource consumption.
SDG 17 (Partnerships for the Goals): This research embodies the spirit of collaboration and partnerships between researchers, institutions and organisations to address global challenges through scientific advances.

Zusammenfassung:
Hintergrund: Im Laufe der Menschheitsgeschichte war die Suche nach den Geheimnissen des Lebens und den Feinheiten der biologischen Materie eine kontinuierliche Reise. Dieses unerbittliche Streben, das mit der Erforschung der natürlichen Welt begann, führte uns allmählich dazu, die molekularen Grundlagen des Lebens zu erforschen und Antworten auf Fragen zu suchen, die unser Verständnis übersteigen. Im Laufe der Jahrhunderte hat die Entwicklung von immer fortschrittlicheren Werkzeugen und Technologien unsere Erforschung der komplizierten Mikroprozesse, die dem Leben selbst zugrunde liegen, erleichtert. Eine dieser bahnbrechenden Technologien ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), die unvergleichliche Einblicke in die Architektur biologischer Prozesse bietet. Während frühe Kryo-EM-Studien auf gereinigte Biomoleküle oder In-situ-Untersuchungen mit begrenzter Auflösung beschränkt waren, haben die jüngsten Fortschritte die Möglichkeiten der Kryo-EM erweitert, um große, flexible und heterogene Komplexe in nativen Zellextrakten zu untersuchen.
Vorläufige Arbeit: Das aufstrebende Gebiet der Untersuchungen von nativen Zellextrakten birgt ein enormes Potenzial, um die hochauflösenden molekularen Signaturen komplexer biologischer Systeme zu entschlüsseln. Eine bemerkenswerte Errungenschaft in diesem Bereich ist die strukturelle Aufklärung der eukaryotischen Fettsäure-Synthase (FAS) aus nativen Zellextrakten, wobei eine bemerkenswerte Auflösung von 4,7 Å erreicht wurde. Diese Studien enthüllten nicht nur strukturelle Details, sondern deckten auch bisher unbekannte biomolekulare Interaktionen und Proteingemeinschaften auf, die Licht in die umfassende molekulare Funktion brachten.
Zielsetzung: Das Hauptziel dieses Forschungsprojekts besteht darin, auf diesen Errungenschaften aufzubauen, indem ein systematischer Ansatz zur Erforschung von Megadalton-Komplexen verwendet wird, die an der Pyruvat-Oxidation, einem grundlegenden Stoffwechselprozess, beteiligt sind. Im Mittelpunkt des Projekts steht der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHc), eine zentrale Baugruppe, die für die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA verantwortlich ist und damit eine Brücke zwischen der Glykolyse und dem Zitronensäurezyklus schlägt. Trotz der umfassenden Charakterisierung seiner isolierten Komponenten bleibt die quaternäre Struktur von PDHc ein Rätsel. Dieses Projekt zielt darauf ab, vollständig assemblierte Chaetomium thermophilum α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe in nativen Zellextrakten zu identifizieren und zu charakterisieren, was tiefe Einblicke in ihre Domänenanordnungen und funktionellen Aktivitäten ermöglicht. Darüber hinaus soll im Rahmen des Projekts die Struktur des PDHc-Kerns durch Kryo-EM aufgeklärt werden, um bisher unbekannte Merkmale zu entdecken.
Methoden: Dieses Forschungsprojekt verwendet einen multidisziplinären Ansatz, der fortschrittliche Techniken wie Massenspektrometrie, Aktivitätsassays, Vernetzung, Elektronenmikroskopie und Computermodellierung kombiniert, um die PDHc-Komplexe umfassend zu charakterisieren. Die Kryo-EM ist der Eckpfeiler für die Bestimmung der Struktur des PDHc-Kerns und bietet damit beispiellose Einblicke in seine räumliche Organisation und den minimalen Reaktionsweg zwischen den einzelnen Enzymen. Diese ganzheitliche Perspektive klärt ein dynamisches Kompartiment auf, das für die Pyruvat-Oxidation verantwortlich ist und von Kern- und peripheren Proteinspezies orchestriert wird.
Auswirkungen: Die Ergebnisse dieses Forschungsprojekts sind von immenser Bedeutung für den wissenschaftlichen Fortschritt, insbesondere für das Verständnis der Struktur und Funktion des PDHc- und α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexes. Durch die direkte Untersuchung dieser großen aktiven Komplexe aus nativen Zellextrakten, die gemeinhin als Metabolone bezeichnet werden, veranschaulicht diese Forschung das Potenzial für einen ganzheitlichen Ansatz zur Entschlüsselung der Zellfunktionen. Darüber hinaus schafft dieses Projekt die Voraussetzungen für eine weitere Integration von Proteomik, Netzwerkbiologie, biophysikalischer Modellierung und maschinellem Lernen, die eine multiskalige molekulare Beschreibung von Proteingemeinschaften in nativen Zellextrakten liefern wird. Dieser integrierte Ansatz verspricht, unser Verständnis der zellulären Funktion auf biophysikalischer Ebene erheblich zu verbessern.
Ausrichtung auf die Ziele für nachhaltige Entwicklung (SDGs): Dieses Forschungsprojekt steht im Einklang mit einer Reihe von Zielen für nachhaltige Entwicklung (Sustainable Development Goals, SDGs), einschließlich, aber nicht beschränkt auf:
SDG 3 (Gute Gesundheit und Wohlbefinden): Durch die Vertiefung unseres Verständnisses grundlegender zellulärer Prozesse kann diese Forschung potenziell zu medizinischen Fortschritten beitragen und die globale Gesundheit verbessern.
SDG 4 (Hochwertige Bildung): Diese Forschung fördert eine qualitativ hochwertige Lehre und Forschung und damit die Qualität der Bildung und den Wissensaustausch innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft.
SDG 7 (Erschwingliche und saubere Energie): Durch ihren multidisziplinären Ansatz und innovative Methoden trägt diese Forschung zur effizienten Nutzung von Energie und Ressourcen in der Wissenschaft bei.
SDG 8 (Menschenwürdige Arbeit und Wirtschaftswachstum): Fortschritte in Wissenschaft und Technologie fördern das Wirtschaftswachstum und die Schaffung von Arbeitsplätzen und tragen so zu menschenwürdigen Arbeitsbedingungen bei.
SDG 9 (Industrie, Innovation und Infrastruktur): Die Entwicklung und Anwendung von Spitzentechnologien und -methoden, wie sie in dieser Forschung gezeigt wurden, können eine wichtige Rolle bei der Förderung von Innovation und Industrie spielen.
SDG 13 (Klimapolitik): Durch die Verbesserung unseres Verständnisses zellulärer Prozesse und die Ermöglichung einer effizienteren wissenschaftlichen Forschung unterstützt dieses Projekt indirekt die Bemühungen um den Klimaschutz, indem es den Ressourcenverbrauch reduziert.
SDG 17 (Partnerschaften für die Ziele): Diese Forschung verkörpert den Geist der Zusammenarbeit und Partnerschaften zwischen Forschern, Institutionen und Organisationen, um globale Herausforderungen durch wissenschaftliche Fortschritte anzugehen.