Cryo-EM, biochemical and computational analysis of S. cerevisiae cell extracts - Insights into the endogenous L-A virus structure

Summary:
Background: This dissertation explores the structural role of flexibility in protein interactions using an integrative computational approach. In particular, it investigates the possibility of analysing organellar and cellular extracts of Saccharomyces cerevisiae to gain high-resolution structural insights into biological systems.
Preliminary work: The study consists of two main parts. In the first part, mitochondrial cell extracts were examined and an optimised isolation method was developed. The efficiency of this method was validated by various analyses that provide information about the interaction of certain proteins with mitochondrial membranes. The second part focused on the analysis of a yeast cell extract enriched with the endogenous L-A virus. This revealed structural details of the virus, including novel capsid-stabilising interactions and the mRNA decoding site embedded in the capsid. In addition, the study identified the presence of tRNA-loaded polysomes and RNA-dependent RNA polymerase within the capsid, highlighting the complex structural milieu of this virus.
Objective: The main objective was to explore the structural intricacies of cell extracts using cryo-electron microscopy (cryo-EM) and computer modelling to improve our understanding of the molecular interactions and structural organisation within these systems.
Methods: A combination of cryo-EM, biochemical analysis, AI-based structural modelling and computational techniques were used to study mitochondrial and cellular extracts to reveal the structural properties, interactions and flexibility of key biomolecular assemblies.
Impact: This research makes an important contribution to structural biology by providing high-resolution insights into the organisation and architecture of cellular components, particularly in native cell extracts. Understanding the structural dynamics of proteins and viruses in their natural context has implications for drug development, virology and cell biology.
Alignment with the Sustainable Development Goals : This research is in line with several Sustainable Development Goals (SDGs). The study of cell extracts and endogenous viruses can support the development of antiviral therapies and thus contribute to SDG 3 (Good health and well-being). Furthermore, the sustainable use of resources in the analysis of cell extracts is in line with SDG 12 (Responsible consumption and production). The study's focus on understanding the structural basis of biological processes supports SDG 4 (Quality education) by increasing knowledge in the field of structural biology. Finally, the research contributes to the wider scientific community by fostering international collaboration, which is in line with SDG 17 (Partnerships for the Goals).

Zusammenfassung:
Hintergrund: Diese Dissertation erforscht die strukturelle Rolle der Flexibilität bei Proteininteraktionen mit Hilfe eines integrativen rechnerischen Ansatzes. Insbesondere wird die Möglichkeit untersucht, organellare und zelluläre Extrakte von Saccharomyces cerevisiae zu analysieren, um hochauflösende strukturelle Erkenntnisse über biologische Systeme zu gewinnen.
Vorarbeiten: Die Studie besteht aus zwei Hauptteilen. Im ersten Teil wurden mitochondriale Zellextrakte untersucht und eine optimierte Isolierungsmethode entwickelt. Die Effizienz dieser Methode wurde durch verschiedene Analysen validiert, die Aufschluss über die Interaktion bestimmter Proteine mit mitochondrialen Membranen geben. Der zweite Teil konzentrierte sich auf die Analyse eines Hefezellextrakts, der mit dem endogenen L-A-Virus angereichert war. Dabei wurden strukturelle Details des Virus aufgedeckt, darunter neuartige kapsidstabilisierende Interaktionen und die in das Kapsid eingebettete mRNA-Entschlüsselungsstelle. Darüber hinaus identifizierte die Studie das Vorhandensein von tRNA-beladenen Polysomen und RNA-abhängiger RNA-Polymerase innerhalb des Kapsids, was das komplexe strukturelle Milieu dieses Virus verdeutlicht.
Zielsetzung: Das Hauptziel bestand darin, die strukturellen Feinheiten von Zellextrakten mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und der Computermodellierung zu erforschen, um unser Verständnis der molekularen Interaktionen und der strukturellen Organisation innerhalb dieser Systeme zu verbessern.
Methoden: Eine Kombination aus Kryo-EM, biochemischer Analyse, KI-basierter Strukturmodellierung und computergestützten Techniken wurde eingesetzt, um mitochondriale und zelluläre Extrakte zu untersuchen und die strukturellen Eigenschaften, Interaktionen und die Flexibilität der wichtigsten biomolekularen Zusammenschlüsse zu enthüllen.
Auswirkungen: Diese Forschung leistet einen wichtigen Beitrag zur Strukturbiologie, indem sie hochauflösende Einblicke in die Organisation und Architektur zellulärer Komponenten liefert, insbesondere in nativen Zellextrakten. Das Verständnis der strukturellen Dynamik von Proteinen und Viren in ihrem natürlichen Kontext hat Auswirkungen auf die Arzneimittelentwicklung, Virologie und Zellbiologie.
Ausrichtung auf die Ziele für nachhaltige Entwicklung: Diese Forschung steht im Einklang mit mehreren Zielen für nachhaltige Entwicklung (SDGs). Die Untersuchung von Zellextrakten und endogenen Viren kann die Entwicklung von antiviralen Therapien unterstützen und damit einen Beitrag zu SDG 3 (Gute Gesundheit und Wohlbefinden) leisten. Außerdem steht die nachhaltige Nutzung von Ressourcen bei der Analyse von Zellextrakten im Einklang mit SDG 12 (Verantwortungsvoller Konsum und Produktion). Der Fokus der Studie auf das Verständnis der strukturellen Grundlagen biologischer Prozesse unterstützt SDG 4 (Qualitative Bildung), indem das Wissen im Bereich der Strukturbiologie erweitert wird. Und schließlich trägt die Forschung zur breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft bei, indem sie die internationale Zusammenarbeit fördert, was dem SDG 17 (Partnerschaften für die Ziele) entspricht.