Bedeutung der Koexpression und Koaktivierung von AT1-, Thromboxan A2- und EGF(HER1)-Rezeptoren für Angiotensin II-vermittelte Signale in vaskulären Zellen: Analyse molekularer und funktioneller Interaktionen

Angiotensin II (Ang II) ist ein wichtiger physiologischer Vasokonstriktor, induziert endotheliale Dysfunktion, vaskuläre Umbauprozesse und induziert Atherosklerose sowie die Bildung abdominaler Aortenaneurysmen durch Aktivierung des AT1-Rezeptors (AT1R). Hinsichtlich der pathologischen Wirkungen von Ang II in vaskulären Zellen wird zunehmend deutlich, dass die parallele Aktivierung zusätzlicher Rezeptortypen eine vollumfänglich Signaltransduktion auslöst.
Unsere Vorarbeiten und die Ergebnisse weiterer Arbeitsgruppen zeigen, dass sowohl der EGF-Rezeptor (EGFR) als auch der Thromboxan A2-Rezeptor (TP) an der Transduktion AT1R-vermittelter Signale beteiligt bzw. für die Auslösung Ang II-induzierter, pathologischer Effekte in vaskulären Zelltypen grundsätzlich nötig sind. Zudem deuten unsere Vorarbeiten auf bisher unbekannte, direkte molekulare Interaktionen von AT1R, TP und EGFR in HEK293, HK-2- und vaskulären Zellen mit möglicher funktioneller Relevanz für die Zelle hin.
Im vorliegenden Projekt soll daher die zentrale Arbeitshypothese geprüft werden, dass die funktionelle und strukturelle Interaktion der Rezeptoren AT1R, TP und EGFR eine synergistische Wirkung auf die durch Ang II-induzierte zelluläre Signaltransduktion, die nachfolgende Steuerung der Genexpression sowie die zellphysiologischen Konsequenzen in Gefäßzellen hat. Für die Überprüfung dieser Hypothese werden Arbeitspakete (AP) auf den Ebenen (i) der biophysikalischen Rezeptorinteraktion, (ii) der zellulären Interaktion nachgeschalteter Signalwege zur transkriptionelle Steuerung sowie (iii) zellphysiologischer Konsequenzen der Rezeptorinteraktion in vitro und in vivo bearbeitet.
Mit Hilfe eines zellbiologischen Ansatzes unter Verwendung von FRET-Mikroskopie (2-Way und 3-Way-FRET-Ansätze) in HEK293-, vaskulären Endothel- und glatten Gefäßmuskelzellen soll untersucht werden, ob sich AT1R-EGFR-TP-Dreierkomplexe bzw. Heterodimere in lebenden Zellen ausbilden (AP1). Zudem wird in diesem Zusammenhang analysiert, wie sich pharmakologische Aktivierung, Kostimulation bzw. pharmakologischer Antagonismus auf Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen und die subzelluläre Verteilung der Rezeptoren auswirken. In weiteren Ansätzen wird der Einfluss der Rezeptorinteraktion auf das Ang II-induzierte Signalosom vaskulärer Zellen mittels Massenspektrometrie und Western Blot (AP2) und die Ang II-vermittelte zelluläre Genexpression (Transkriptom- und nachfolgende Validierungsanalysen; AP3) untersucht, gefolgt von bioinformatischer Analyse der Upstream-Komponenten und Downstream-Konsequenzen. In einem weiteren Arbeitspaket wird die Bedeutung der Rezeptorinteraktion für den durch Ang II-induzierten Phänotyp bzw. die veränderte Funktion vaskulärer Endothel- sowie glatter Gefäßmuskelzellen in vitro charakterisiert (AP4). Im späteren Projektverlauf soll letztlich die Bedeutung vaskulärer EGFR und TP für die durch Ang II-induzierte Atherogenese und die Atherosklerose-assoziierte Aneurysmenbildung unter Verwendung Ldlr-defizienter Endothel- und VSMC-spezifischer TP- sowie EGFR-Knockout-Mäuse in vivo untersucht werden (AP5).
Wir erwarten, dass das Projekt zur Klärung der Bedeutung funktioneller und molekularer Interaktionen zwischen AT1R, TP und EGFR für Ang II-vermittelte Effekte auf vaskuläre Zellen beitragen wird. Die Verbesserung des mechanistischen Verständnisses kann langfristig die Entwicklung rationaler Therapiestrategien unterstützen.

Angiotensin II (Ang II) is an important vasoconstrictor and induces endothelial dysfunction, vascular remodeling, atherosclerosis and atherosclerosis-associated complications, e.g. the formation of abdominal aortic aneurysms (AAA), through activation of the AT1 receptor (AT1R). Regarding the pathological effects of Ang II, there is increasing evidence that activation of further receptors is necessary to effectively transduce Ang II-related signals in the vascular system.
Data from our and other groups indicate that Thromboxane A2 (TP) and EGF(HER1) receptors (EGFR) participate in AT1R-elicited cellular signal transduction and may even be essential for pathological signaling of Ang II in vascular cell types. Moreover, unpublished work from our group demonstrates previously unrecognized molecular interactions of AT1R, TP and EGFR in HEK293, HK-2-, and vascular endothelial cells.
In the present project, we will therefore test the hypothesis that both functional and molecular interactions of AT1R, TP, and EGFR synergize to promote Ang II-related changes in signaling, gene expression, and cellular phenotype/function of vascular cell types. To check this hypothesis, we have defined 5 different work packages (WP) on the level of (i) biophysical receptor interactions, (ii) interactions of downstream signaling events relevant for the regulation of cellular gene expression, and (iii) cell physiological consequences of these receptor interactions in vitro und in vivo.
Using FRET microscopy techniques (2-way und 3-way-FRET set ups) in HEK293-, vascular endothelial-, and smooth muscle cells, we will analyze whether AT1R, TP, and EGFR form heterotrimeric (AT1R-EGFR-TP) complexes or heterodimers in living cells (WP1). Moreover, we will investigate whether receptor interactions as well as subcellular receptor distributions are affected through pharmacological activation, costimulation, or inhibition of AT1R, TP, and EGFR. Using mass spectrometry, Western Blot, RNAseq and qPCR analyses, we will examine the impact of AT1R-TP-EGFR interactions on the Ang II-related signalosome (WP2) and gene expression (transcriptome and subsequent validation experiments; WP3) of vascular cells. Moreover, we will evaluate the impact of AT1R-TP-EGFR interactions on the Ang II-induced phenotype of vascular cells in vitro (WP4). Lastly, we will investigate, whether endothelial- or vascular smooth muscle cell (VSMC)-specific TP and/or EGFR deficiency affect spontaneous and Ang II-induced atherosclerosis and the formation of AAA in the Ldlr knockout mouse model of atherogenesis in vivo (WP5).
We believe that our project will help to clarify the significance of functional and molecular AT1R-TP-EGFR interactions in the context of Ang II-related vascular pathology in vitro and in vivo.