Molekulare Mechanismen der nicht-genotropen AldosteronwirkungAldosteron spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Salz- und Wasserhaushalt sowie bei pathologischen kardiovaskulären und renalen Veränderungen. Wie für andere Steroide wurden für Aldosteron Effekte beschrieben, die nicht auf einem direkten genomischen Mechanismus beruhen. Es liegt also ein dualer Wirkmechanismus vor: genomisch und nicht-genotrop. Wie auch von uns gezeigt, werden nicht-genotrope Effekte teilweise durch den klassischen humanen Mineralokortikoid-Rezeptor (hMR) vermittelt und hängen vom Crosstalk mit dem Epidermal Growth Factor-Rezeptor (EGFR) ab. hMR benutzt EGFR als heterologes Signaltransduktionssystem. Wir wollen die Rolle der verschiedenen Domänen des klassischen hMR bezüglich nicht-genotroper Wirkungen auf molekularer Ebene charakterisieren sowie deren Interaktion mit EGF-Rezeptoren untersuchen. Weiterhin werden wir die transkriptionelle Bedeutung nicht-genotroper Signale mit geeigneten Konstrukten testen sowie die Beeinflussung der genomischen Wirkung durch Signale des nicht-genotropen Weges untersuchen. Zu diesem Zweck verwenden wir heterologe Expressionssysteme mit geeigneten hMR-Konstrukten und humanen EGF-Rezeptoren.Aldosteron-induzierte Expression des EGF-RezeptorsAldosteron führt am Herzen, an Gefäßen sowie an der Niere zu pathologischen Gewebe-veränderungen, wie Fibrose und Entzündung. Diese Rolle wird durch die klinische RALES-Studie unterstützt, die zeigt, dass Aldosteronantagonisten die Mortalitätsrate bei Herzinsuffizienz senken. Die beteiligten Vorgänge sind unklar. Somit besteht Handlungs-bedarf bezüglich Aufklärung der Mechanismen dieser pathologischen Aldosteronwirkung. Da wachstumsfaktor- und zytokintypische Signalwege wahrscheinlich eine Rolle spielen, stellt die Wechselwirkung von Aldosteron mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) einen attraktiven Erklärungsansatz dar: (i) EGF fördert proliferative und fibrotische Veränderungen an kardiovaskulärem und renalem Gewebe. (ii) Bei Tieren mit mineralokortikoidinduzierter Hypertonie findet sich eine erhöhte vaskuläre EGF-Empfindlichkeit. (iii) Literaturdaten und unsere Vorversuche zeigen, dass Aldosteron die Expression des EGF-Rezeptors (EGFR) stimulieren kann. Diese Befunde stehen im Einklang mit oben genannter Hypothese und können zur Erklärung der pathologischen Wirkung von Aldosteron beitragen. In unserem Projekt sollen Mechanismen und Konsequenzen der mineralokortikoidrezeptorinduzierten EGFR-Expression untersucht werden. Transportphysiologie und pathophysiologieViele wichtige Medikamente (z.B. Antibiotika, Zytostatika, Zyklooxygenasehemmer) und endogene Substrate wie Prostaglandine, Urat und Oxalat sind organische Anionen. Das renale Sekretionsssystem für organische Anionen ist im proximalen Tubulus lokalisiert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist die basolaterale Aufnahme organischer Anionen. Die Aktivität dieses renalen Sekretionssystems entscheidet über Konzentration und Verweildauer organischer Anionen im Organismus, sie ist also mitentscheidend für Wirkung oder Toxizität dieser Substanzen. Bisher sind noch keine konkreten Signalwege bekannt, die den renalen organischen Anionentransport auf Expressionsebene regulieren.Durch Studien an Ratten konnten wir zeigen, (i) dass nach renaler Ischämie die Sekretion organischer Anionen reversibel gehemmt ist. (ii) Das gilt auch für die Expression der Proteine, welche den geschwindigkeitsbestimmenden, basolateralen Schritt der Sekretion vermitteln. (iii) Diese Ergebnisse konnten wir an einem in vitro-Ischämie-Modell an proximalen Tubuluszellen der Ratte reproduzieren. (iiii) Studien am Ischämie-Modell mit Zyklooxygenasehemmern und Prostaglandin E2 legen eine Beteiligung von Prostaglandin E2 an der durch Ischämie induzierten Expressionshemmung nahe.Daraus ergibt sich eine attraktive Hypothese zum Mechanismus der durch Ischämie induzierten Hemmung der renalen Sekretion organischer Anionen: Ischämie induziert die Bildung von Prostaglandin E2, welches zur Expressionshemmung der basolateralen Transportproteine für organische Anionen führt. In unserem Projekt sollen die Mechanismen der durch Ischämie induzierten Expressionshemmung der basolateralen Transportproteine für organische Anionen untersucht werden. Dabei sollen erstmals konkrete Signalwege beschrieben werden, die die renale Sekretion organischer Anionen regulieren.Einfluss des metabolischen Mikromilieus solider Tumoren auf die Aktivität von Medikamententransportern: Bedeutung für die Chemosensibilität von Tumoren in vivo.Sowohl experimentelle als auch humane Tumoren zeigen im Vergleich zu Normalgeweben ein deutlich verändertes metabolisches Mikromilieu. So lässt sich in über 50% der klinischen Tumoren ein ausgeprägter O2-Mangel (Hypoxie) nachweisen. Um trotzdem eine ausreichende Energieversorgung sicher zu stellen, forciert die Tumorzelle den anaeroben Stoffwechselweg, wobei Glukose direkt zu Milchsäure umgesetzt wird, sodass sich in vielen Tumoren ein ausgeprägter Glukosemangel, eine Laktatzunahme sowie eine starke extrazelluläre Azidose (pH<6,8) nachweisen lässt. Auf der anderen Seite ist seit längerer Zeit bekannt, dass die Tumorhypoxie die Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika einschränkt. So benötigen einige Pharmaka molekularen Sauerstoff, um ihre zytotoxische Wirksamkeit zu entfalten (z.B. Alkylatien). Jedoch müssen auch indirekte Effekte des O2-Mangels berücksichtigt werden, wie beispielsweise eine Beeinflussung der Pharmakokinetik durch die extrazelluläre Azidose.Auf der anderen Seite verfügen viele Tumorzellen über aktive Transportmechanismen, die Pharmaka unter direktem ATP-Verbrauch aus der Zelle transportieren können (ABC-Transporter), deren wichtigste Vertreter das p-Glykoprotein (pGP, Produkt des MDR1-Gens) sowie das Multidrug-resistance associated protein 1 (MRP1) sind. Da zahlreiche solide wachsende Tumoren diese Transporter exprimieren, werden sie für ein vermindertes Ansprechen dieser Malignome gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika verantwortlich gemacht. Andererseits könnte die Hemmung dieser Medikamententransporter zu einer Steigerung der zytotoxischen Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika führen. Die Aktivität dieser ABC-Transporter kann durch verschiedene Zytokine, Onkogene oder Tumorsupressorgene beeinflusst werden, wobei sowohl die Expression der Transporter als auch deren funktionelle Transportleistung einer Modulation zu unterliegen scheinen. Über eine Beeinflussung der Transporter-Aktivität durch das metabolische Mikromilieu (Hypoxie, Azidose, Hypoglykämie) ist bisher nur sehr wenig bekannt. Eigene Vorarbeiten deuten jedoch darauf hin, dass metabolische Veränderungen im Tumor zu einer Steigerung der Pumpenaktivität und somit zu einer erhöhten Resistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika führen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind bisher jedoch nicht bekannt.Die Rolle der zellulären Calcium-Homöostase im Rahmen Cyclophosphamid- und Ifosfamid-induzierter Nierenschäden: Untersuchungen an humanen proximalen Tubuluszellen in PrimärkulturMortalität und Morbidität bösartiger Erkrankungen können durch den Einsatz von Zytostatika wie Cyclophosphamid und Ifosfamid deutlich gebessert werden. In der pädiatrischen Onkologie ist in bis zu 70 % der Fälle eine Heilung der Grunderkrankung möglich. Allerdings spielen Langzeitnebenwirkungen der Therapie im Hinblick auf die Prognose eine zunehmende Rolle. Eine wichtige Langzeitkomplikation ist die Einschränkung der tubulären Nierenfunktion. Der zugrundeliegende Mechanismus ist bislang ungeklärt. Eine Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktion und somit zellulärer Funktionen ist ein möglicher Pathomechanismus für die Entstehung von Nierenschäden durch Zytostatika. Eine Schlüsselstellung in der Signaltransduktion nimmt die zytosolische Calciumkonzentration ein. Ziel unseres Vorhabens ist es, die Wirkung von Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren Metaboliten auf die Calciumhomöostase und damit verwobene Signaltransduktionsmechanismen in menschlichen proximalen Tubuluszellen zu untersuchen. Ein genaueres Verständnis solcher Interaktionen kann mit zur Entwicklung spezifischer Präventions- und/oder Therapiemethoden der Langzeitnebenwirkungen beitragen.Gefährdung der Lebensmittelsicherheit durch Mykotoxine: Untersuchung an humanen Zellen in PrimärkulturBei Mykotoxinen handelt es sich um Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen, die auf zahlreichen Lebens- und Futtermitteln zu finden sind und aufgrund ihrer vielfältigen toxikologischen Effekte zu einer gesundheitlichen Beeinträchtigung führen können. Leider sind die zugrunde liegenden Pathomechanismen, besonders an humanem Zellmaterial, noch nicht ausreichend geklärt. Die bisher erhobenen Daten basieren auf Tierstudien bzw. auf Untersuchungen mit Zelllinien tierischen Ursprungs, und die Ergebnisse lassen sich nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen. Grundsätzlich sind bei toxischer Einschränkung der Gewebefunktion drei Pathomechanismen von Bedeutung: Entzündung, Fibrose und Apoptose. Bei deren Entstehung und Verlauf spielt die Expression bestimmter Genprodukte (z.B. Zytokine, Matrixproteine) eine wichtige Rolle. Es besteht somit Handlungsbedarf in dreifacher Hinsicht: (a) die Induktion der Pathomechanismen Apoptose, Fibrose und Entzündung an humanen Zellen zu untersuchen, (b) die Dosis-Wirkungsbeziehung zu ermitteln und © die zugrunde liegende Veränderung der Genexpression zu charakterisieren. Zu diesem Zweck werden wir die Beeinflussung der genannten Parameter an unterschiedlichen humanen Zellen in Primärkultur durch Exposition toxikologisch relevanter Konzentrationen der, für den Verbraucher relevanten, Mykotoxine Ochratoxin, Fumonisine, Zearalenon und Deoxynivalenol untersuchen. Untersuchungen an humanen Zellen in Primärkultur ermöglichen in Kombination mit der gut bekannten Toxokinetik eine Abschätzung des Risikos für den Menschen.Physiologie und Pathophysiologie der Proteinendozytose in renalen proximalen Tubuluszellen.In der Niere werden Proteine des Blutplasmas unter physiologischen Bedingungen nur eingeschränkt glomerulär filtriert. Diese filtrierten Proteine werden anschließend im proximalen Tubulus des Nephrons durch Rezeptor-vermittelte Endozytose resorbiert. Durch diese Resorption wird zum einen der Verlust von Aminosäuren, zum anderen jedoch auch der Verlust von anderen wertvollen Substanzen, wie Vitamine, verhindert. Außerdem ist diese Endozytose dafür verantwortlich, dass (i) die Vitamin-D-Vorstufe zur endgültigen Aktivierung in die proximalen Tubuluszellen gelangt und (ii), dass die Oberflächenexpression von Membranproteinen adäquat reguliert wird. Der größte Teil der Endozytose wird durch den Rezeptorkomplex Megalin/Cubilin vermittelt. Der geschilderten Endozytose kommt eine dreifache pathophysiologische Bedeutung zu: Verminderte Endozytose führt zum Verlust von Aminosäuren und Vitaminen; bei vermehrtem Proteinangebot führt die vermehrte Proteinendozytose zu pathologischen - sowohl fibrotischen als auch entzündlichen - Veränderungen des Nierengewebes; veränderte Endozytoseraten können zu pathologisch veränderter Oberflächenexpression von Membranproteinen führen. Das Ziel unseres Projektes ist es, (a) die Mechanismen der physiologischen und pathophysiologischen Regulation der Endozytose besser zu verstehen und (b) die zellulären Vorgänge im Rahmen der proteininduzierten Veränderungen sowie deren Modulierbarkeit genauer zu charakterisieren. Die erhobenen Befunde sollen auch langfristig dazu beitragen Therapiekonzepte im Rahmen von interstitiellen Nierenerkrankungen zu entwickeln.Entwicklung von Therapiestrategien zur Verhinderung proteinurieinduzierter interstitieller NierenschädenFortschreitende interstitielle Fibrose (bindegewebiger Umbau) der Niere ist bei vielen Erkrankungen für die Entwicklung eines chronischen Nierenversagens (ca. 10.000 Neuerkranungen/Jahr in Deutschland) entscheidend. Dieses führt zu lebensbedrohlichen Veränderungen des Salz-, Wasser-, Vitamin- und Hormonhaushaltes sowie der Entgiftungsfunktion, wodurch eine Nierenersatztherapie (Dialyse, Transplantation) notwendig wird. Das Fortschreiten der Fibrose wird ganz wesentlich durch die Wechselwirkung bestimmter Zellen der Nierenkanälchen (proximale Tubuli) mit filtrierten Proteinen bestimmt. Diese Zellen üben bei vermehrter Proteinfiltration eine profibrotische und proinflammatorische Wirkung aus. Die Rolle der Proteinaufnahme in diese proximalen Tubuluszellen sowie der anschließend ablaufenden Signalvorgänge für die Entwicklung der Fibrose ist größtenteils noch nicht bekannt. Ziel unseres Vorhabens ist die genaue Charakterisierung der Bedeutung von Proteinaufnahme und der verantwortlichen Signalvorgänge im Rahmen der Fibroseentwicklung und das Austesten daraus abgeleiteter Therapiestrategien. Unsere Ergebnisse sollen zur Entwicklung von Therapiekonzepten bei interstitiellen Nierenerkrankungen beitragen.