Regulation von PI4P 5-Kinasen aus Arabidopsis durch Phosphorylierung

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns(4,5)P2) ist ein regulatorisches Phospholipid, das die spezifische Kontrolle von Lokalisierung oder Aktivität von Zielproteinen mit housekeeping-Funktionen oder bei der Stressadaptation steuert. PtdIns(4,5)P2 wird durch PI4P 5-Kinasen gebildet, die in Arabidopsis als Enzymfamilie aus 11 Isoenzymen vorliegen. In vorhergehenden Arbeiten haben wir mehrere PI4P 5-Kinasen identifiziert, die für Arabidopsis essenziell sind. In verschiedenen eukaryotischen Modellsystemen werden PI4P 5-Kinasen durch posttranslationale Modifikation reguliert und es wurde gezeigt, dass verschiedene PI4P 5-Kinasen aus Arabidopsis phosphoryliert werden können. Bislang blieb jedoch ungeklärt, i) unter welchen Umständen Phosphorylierung vorliegt, ii) welche Aminosäuren phosphoryliert werden, und iii) was die Konsequenzen hinsichtlich Lokalisierung und Funktionalität der Enzyme sind. Daher soll die Phosphorylierung von PI4P 5-Kinasen in Arabidopsis untersucht werden. Die Phosphorylierungsstellen werden bestimmt und die respektiven Aminosäuren in Alanin- oder Aspartatreste umgewandelt, um konstitutiv dephosphorylierte oder phosphorylierte Varianten zu simulieren. Rekombinante variante Proteine werden dann in vitro biochemisch charakterisiert. Die subzelluläre Lokalisierung fluoreszenzmarkierter Proteine wird während transienter Expression in heterologen Systemen (Schließzellen von Vicia faba oder Tabakpollenschläuchen) und bei stabiler Expression in Arabidopsis untersucht. Physiologische Funktionalität wird durch Komplementierung der bereits existierenden Arabidopsis T-DNA Insertionsmutanten getestet.