Methodenentwicklung und Anwendung für die Kryo-Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung:
Hintergrund: Biomolekulare Komplexe spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung der zellulären Struktur und Funktion. Ihre komplizierten Interaktionen sind für das Verständnis des Innenlebens von Zellen unerlässlich. Der Aufbau dieser Komplexe ist jedoch oft flüchtig und strukturell schwer zu analysieren. In diesem Abstract wird ein neuartiger Ansatz vorgestellt, bei dem die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) eingesetzt wird, um eine sehr heterogene biochemische Fraktion aus Zellextrakten von Chaetomium thermophilum zu untersuchen, die Einblicke in die Architektur eukaryontischer biomolekularer Komplexe gewährt.
Vorläufige Arbeit: Die jüngsten Entwicklungen in der Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) haben die Bestimmung von Proteinstrukturen aus extrem kleinen Kristallen ermöglicht. Diese Methode ist jedoch auf ultradünne Proteinkristalle beschränkt, und die Vollständigkeit der Daten wird durch die Form und Ausrichtung der Kristalle beeinflusst. In dieser Arbeit wird die Anwendung der MicroED untersucht, um die Struktur eines Komplexes zwischen einer Enzymregulationsdomäne und einem intrinsisch ungeordneten Peptid aufzudecken und dabei die mit der Kristallgröße und -ausrichtung verbundenen Herausforderungen zu überwinden.
Zielsetzung: Ziel dieser Forschungsarbeit ist es, die Organisation und Struktur des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (OGDHc), einem zentralen Akteur des Stoffwechsels, zu entschlüsseln. Durch den Einsatz einer Kombination aus biochemischen, biophysikalischen und bioinformatischen Techniken soll die Zusammensetzung, die 3D-Architektur und die molekulare Funktion der nativen OGDHc bestimmt werden. Darüber hinaus soll sie eine Grundlage für Struktur-Funktions-Studien komplexer Mischungen mit medizinischer und biotechnologischer Bedeutung liefern.
Methoden: Die Forschung setzt Kryo-EM- und MicroED-Techniken ein, um die Architektur komplexer zellulärer Strukturen zu untersuchen. In der ersten Studie wird die Kryo-EM zur Visualisierung einer sehr heterogenen biochemischen Fraktion aus Zellextrakten von C. thermophilum verwendet. In der zweiten Studie wird MicroED eingesetzt, um die Struktur eines neuartigen Enzymkomplexes zu bestimmen. Dabei werden nadelartige Kristalle und die Datenerfassung mit einem High-End-Cryo-TEM-System verwendet.
Auswirkungen: Die Anwendung der Kryo-EM zur Analyse von Zellextrakten hat das Potenzial, die Strukturanalyse biomolekularer Komplexe erheblich zu beschleunigen und bietet einen ganzheitlichen Ansatz für die Annotation ihrer Architektur. Die Entwicklung eines effektiven Arbeitsablaufs für die Sammlung von Elektronenbeugungsdaten aus nadelartigen Proteinkristallen in der zweiten Studie erweitert die Möglichkeiten von MicroED. Darüber hinaus liefert die dritte Studie, die das OGDHc und seine Interaktionen untersucht, wertvolle Erkenntnisse für die medizinische und biotechnologische Forschung.
Ausrichtung auf die Ziele für nachhaltige Entwicklung: Diese Forschung trägt zu den Zielen für nachhaltige Entwicklung (SDGs) bei, indem sie unser Verständnis von zellulären Prozessen und Strukturen verbessert. Die aus der Untersuchung biomolekularer Komplexe gewonnenen Erkenntnisse können sich auf das Gesundheitswesen und die Biotechnologie auswirken und stehen im Einklang mit SDG 3 (Gute Gesundheit und Wohlbefinden) und SDG 9 (Industrie, Innovation und Infrastruktur). Darüber hinaus steht die Entwicklung effizienterer Strukturanalysetechniken im Einklang mit SDG 9, da sie den technologischen Fortschritt fördert. Zusätzlich zu den oben genannten SDGs ist es erwähnenswert, dass dieses Projekt indirekt die Förderung einer qualitativ hochwertigen Bildung (SDG 4) unterstützt, indem es eine Grundlage für Struktur-Funktions-Studien mit medizinischer und biotechnologischer Bedeutung bietet. Diese Forschung dient nicht nur dem Wissenszuwachs, sondern bietet auch Möglichkeiten zur Aus- und Weiterbildung in modernsten Techniken und Methoden im Bereich der Strukturbiologie.

Summary:
Background: Biomolecular complexes play a crucial role in controlling cellular structure and function. Their intricate interactions are essential for understanding the inner workings of cells. However, the assembly of these complexes is often elusive and structurally difficult to analyse. This research project presents a novel approach using cryo-electron microscopy (cryo-EM) to study a highly heterogeneous biochemical fraction from cell extracts of Chaetomium thermophilum that provides insights into the architecture of eukaryotic biomolecular complexes as well as the study of biomolecules from overexpressed systems.
Preliminary work: Recent developments in microcrystal electron diffraction (MicroED) have enabled the determination of protein structures from extremely small crystals. However, this method is limited to ultra-thin protein crystals and the completeness of the data is affected by the shape and orientation of the crystals. In this work, we explore the application of MicroED to reveal the structure of complexes, including a complex between an enzyme regulatory domain and an intrinsically disordered peptide, overcoming the challenges associated with crystal size and orientation.
Objective: Another aim of this research is to also decipher the organisation and structure of the oxoglutarate dehydrogenase complex (OGDHc), a central player in metabolism. Using a combination of biochemical, biophysical and bioinformatics techniques, the project aims to determine the composition, 3D architecture and molecular function of native OGDHc. Furthermore, it will provide a basis for structure-function studies of complex mixtures with medical and biotechnological relevance.
Methods: The research uses cryo-EM and MicroED techniques to study the architecture of complex cellular structures. In the first study, cryo-EM is used to visualise a very heterogeneous biochemical fraction from cell extracts of C. thermophilum. In the second study, MicroED is used to determine the structure of a novel enzyme complex. Needle-like crystals and data acquisition with a high-end cryo-TEM system are used.
Implications: The application of cryo-EM to the analysis of cell extracts has the potential to significantly accelerate the structural analysis of biomolecular complexes and provides a holistic approach to the annotation of their architecture. The development of an effective workflow for collecting electron diffraction data from needle-like protein crystals in the second study extends the capabilities of MicroED. In addition, the third study, which investigates the OGDHc and its interactions, provides valuable insights for medical and biotechnological research.
Alignment with the Sustainable Development Goals: This research contributes to the Sustainable Development Goals (SDGs) by improving our understanding of cellular processes and structures. The knowledge gained from the study of biomolecular complexes can have an impact on healthcare and biotechnology and is in line with SDG 3 (Good Health and Wellbeing) and SDG 9 (Industry, Innovation and Infrastructure). Furthermore, the development of more efficient structural analysis techniques is in line with SDG 9 as it promotes technological progress. In addition to the above SDGs, it is worth noting that this project indirectly supports the promotion of quality education (SDG 4) by providing a basis for structure-function studies with medical and biotechnological relevance. This research not only serves to increase knowledge, but also provides opportunities for education and training in state-of-the-art techniques and methods in the field of structural biology.