Identifizierung essentieller Gene in Leukämiezellen mittels CRISPR/Cas9

Leukämien stellen nicht nur auf Ebene der Klassifizierung bzw. Herkunft und Verlauf, sondern auch auf molekularer und genetischer Ebene eine äußerst heterogene Erkrankung dar. Diese Heterogenität setzt sich auf Einzelzellebene noch weiter fort und ist verantwortlich für die unterschiedlichen Abhängigkeiten von Signalwegen und erschwert die effektive therapeutische Behandlung.
Die gezielte Veränderung des Genoms mit Hilfe von CRISPR/Cas9 eröffnet eine völlig neue Herangehensweise zur Aufklärung von genetischen Abhängigkeiten in Tumorzellen. CRISPR Screens erlauben dabei eine systematische Identifizierung von Genen, welche für das Überleben und die Vermehrung von Krebszellen nötig sind. So hat ein umfangreicher CRISPR/Cas9 Screen in 14 AML-Linien ergeben, dass insbesondere RNA-abhängige Prozesse (Ribosomen; RNA-Transkription; RNA-Spleißen) für sämtliche untersuchten Zelllinien essentiell sind (Wang et al., 2017). Ähnliche Abhängigkeiten von RNA-Prozessen findet man auch in anderen Krebsarten. Es ist jedoch unklar, welche RNA-bindenden Proteine hierbei besonders für Leukämien relevant sind bzw. essentielle Funktionen in den spezifischen Leukämiearten (z.B. AML vs. CML) übernehmen.
Ziel dieses Antrages ist es daher 1) essentielle Gene zu identifizieren, welche spezifisch für das Überleben von Leukämiekrebszellen wichtig sind ohne dabei das Überleben von Nicht-Leukämiezellen zu beeinflussen, und 2) die Rolle von RNA-bindenden Proteinen in der Leukämieentwicklung und Therapieresistenz zu erforschen. Damit könnten zum einen neue Erkenntnisse über die Regulation der Genexpression in Leukämiezellen gewonnen werden und zum anderen neue Leukämietherapien mit möglichst geringen Nebenwirkungen entwickelt werden.
Um diese Ziele zu erreichen werden wir einerseits auf publizierte, genomweite CRISPR/Cas9 Screens in verschiedenen humanen Krebszelllinien zurückgreifen und diese entsprechend re-analysieren. Gene, welche nur in Leukämiezellen aber nicht in soliden Tumorzellen überlebenswichtig sind werden weiterhin auf ihre Subtyp-spezifische Rolle in CML- und AML-Zellen funktionell untersucht. Hierzu werden wir die Expression ausgewählter Kandidatengene im Zellkulturmodell modulieren und deren Einfluss auf Zellviabilität, Proliferation und Differenzierung analysieren. Eventuell vorhandene Inhibitoren dieser Kandidaten werden ebenso auf ihre Wirksamkeit und Spezifität getestet. Einen besonderen Stellenwert unserer zellbiologischen Untersuchungen werden dabei die RNA-bindenden Proteinen einnehmen, deren Funktionen und Interaktionen wir durch molekularbiologische und biochemische Studien näher beleuchten werden. Des Weiteren wollen wir eine fokussierte CRISPR/Cas9-Plattform aufbauen, welche es uns ermöglicht essentielle RNA-bindende Proteinen durch eigene genetische Screens in weiteren Tumorzelllinien zu identifizieren und deren Rolle in der Signalverarbeitung sowie Therapieresistenz in Leukämien aufzudecken.
Die im Rahmen dieses Projektes gewonnen Erkenntnisse und entwickelten Techniken bilden somit die Grundlage für zukünftige weiterführende, mechanistische und translationale Forschungsvorhaben.