Studien zur Struktur und Stabilität von Phospholipase D (Brassica oleracea)

Phospholipase D (PLD) katalysiert die Hydrolyse der terminalen Phosphodiesterbindung in Glycerophospholipiden. Aufgrund ihrer Fähigkeit, in Gegenwart geeigneter Alkohole auch die Umesterung der polaren Kopfgruppe (z. B. des Cholins in Phosphatidylcholin) zu katalysieren, wird das Enzym pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft bereits seit etlichen Jahren zur Synthese von Phospholipiden mit modifizierten Kopfgruppen genutzt. In jüngster Zeit hat PLD darüber hinaus große Aufmerksamkeit gewonnen, weil ihre Beteiligung in Signaltransduktionsprozessen erkannt wurde. Trotz des ständig angestiegenen Interesses an dem Enzym und einer Vielzahl aufgeklärter Genstrukturen, sind Informationen zur Proteinstruktur, der Stabilität und dem Katalysemechanismus des Enzyms bisher sehr rar. In der Arbeitsgruppe wird PLD seit einigen Jahren unter anwendungsorientierten Gesichtspunkten bearbeitet. Dabei gelang es, zwei Isoenzymen der PLD aus Weißkohl (PLD1 und PLD2) zu identifizieren und ihre Genstruktur aufzuklären. Es wurde ein Verfahren zur rekombinanten Gewinnung und einfachen Reinigung dieser Enzyme entwickelt, so daß es jetzt möglich ist, die einzelnen Isoenzyme zu untersuchen und auf gentechnischem Wege sowohl neue Informationen über das Enzym zu sammeln als auch seine Eigenschaften im Sinne der Anwendung zu verbessern. Im Rahmen der Promotionsarbeit soll der für die Enzymanwendung besonders wichtige Aspekt der Stabilität der PLD1 und PLD2 betrachtet werden.Mittels spektroskopischer (CD- und Fluoreszenzspektroskopie), calorimetrischer (Differential scanning calorimetry) und proteinchemischer Methoden (limitierte Proteolyse in Kombination mit Elektrophorese, N-terminaler Sequenzierung und Massenspektrometrie) sowie Aktivitätsmessungen soll die Entfaltung und Rückfaltung von PLD1 und PLD2 untersucht werden. Durch Mutationsstudien (Herstellung und Untersuchung von Deletionsmutanten des Proteins bzw. von isolierten Proteindömänen) sollen Aussagen über den Stabilitätsbeitrag einzelner Strukturregionen (z. B. der C2-Domäne) erarbeitet werden.