Studien zur Gewinnung und gentechnischen Modifizierung von Phospholipase D aus Schlafmohn (Papaver somniferum L.) und Weißkohl (Brassica oleracea var. capitata)

Phospholipase D (PLD) katalysiert die Hydrolyse der terminalen Phosphodiesterbindung von Glycerophospholipiden. In Gegenwart eines geeigneten Akzeptoralkohols sind die meisten PLDs außerdem in der Lage, den Phosphatidylrest durch eine sogenannte Transphosphatidylierungsreaktion auf diesen Alkohol zu übertragen.Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Identifizierung und Sequenzierung der Gene von zwei im Schlafmohn vorkommenden PLD-Isoenzymen, PLD1 und PLD2. Diese bestehen aus 2829 bzw. 2828 bp und enthalten eine Intronstruktur. Wie die anderen PLD-Aktivität aufweisenden Mitglieder der PLD-Superfamilie besitzen die Mohn-PLD-Isoenzyme die bei allen pflanzlichen PLDs vorkommenden konservierten Sequenzbereiche I bis IV, darunter die zwei katalytischen HKD-Motive. Am N-Terminus befindet sich die für die Ca2+-vermittelte Phospholipidbindung verantwortliche C2-Domäne. Beide Enzyme wurden in Escherichia coli in löslicher Form exprimiert und mittels hydrophober Interaktionschromatographie und Ca2+-abhängiger hydrophober Interaktionschromatographie gereinigt. Das pH-Optimum für die Hydrolysereaktion von PLD1 und PLD2 lag bei pH 5,5 bis 6,0. Die optimale Ca2+-Konzentration für beide Enzyme betrug 200 mM. Beide Enzyme besaßen vergleichbare Aktivitäten bei der Hydrolyse, wiesen jedoch signifikante Unterschiede bei der Transphosphatidylierung von Phospholipiden auf, obwohl sich die beiden rekombinanten Mohn-PLDs in nur 11 Aminosäuren voneinander unterscheiden.Aufbauend auf multiplen Alignments, Sekundärstrukturvorhersagen und Hydrophobizitäts-vergleichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit die Bereiche des ersten und zweiten HKD-Motives, der bei pflanzlichen PLDs hoch-konservierte C-Terminus sowie die 8 in pflanzlichen PLDs ebenfalls hoch-konservierten Cystein-Reste für Mutationsstudien an einer etablierten rekombinanten PLD2 aus Weißkohl ausgewählt. Aufgrund der Messungen der Hydrolyse- und Transphosphatidylierungsaktivitäten der 35 generierten Kohl-PLD2-Enzymvarianten konnten neben der Bestätigung der Bedeutung der HKD-Motive für den Katalysemechanismus, der C-Terminus sowie die hoch-konservierten Cystein-Reste als Strukturelemente identifiziert werden, die einen signifikanten Einfluss auf die hydrolytische Aktivität bzw. die Transphosphatidylierungsaktivität haben.