Strukturloops als Determinanten der Proteinstabilität - Entfaltungsstudien am Beispiel von Barstar und der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus

Das Arbeitskonzept baut auf der in der Arbeitsgruppe entwickelten Hypothese auf, dass lokale Fluktuationen von loop-Regionen der Proteinstruktur den Entfaltungsprozess des Moleküls determinieren und damit entscheidend für die Stabilität des Proteins sind. In der von der Studienstiftung des deutschen Volkes geförderten Promotionsarbeit soll der Einfluss von loop-Regionen auf die bei der Proteinentfaltung auftretenden Konformationsänderungen mittels Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie und 1H-NMR, kombiniert mit H/D-Austausch, untersucht werden. An dem Modellprotein Barstar, dem aus 89 Aminosäureresten bestehenden Inhibitor der intrazellulären Ribonuclease aus Bacillus amyloliquefaciens, sollen mit Hilfe von H/D-Austauschstudien die Strukturbereiche ermittelt werden, die im nativen Zustand des Moleküls fluktuieren. Ausgehend von diesen Daten sollen cysteinhaltige Varianten des Proteins hergestellt werden, die eine Kopplung von FRET-und Elektronentransfer-Markern möglich machen. Mittels Einzelmolekülspektroskopie sollen an ausgewählten Varianten simultan Entfaltung und Konformationsfluktuationen untersucht werden. Als zweites Modellprotein soll die aus zwei Domänen aufgebaute neutrale Protease aus Bacillus stearothermophilus dienen, für die bereits mehrere cysteinhaltige Varianten vorhanden sind. Die am Barstar gewonnenen Erkenntnisse sollen für die Analyse der Entfaltung dieses komplexeren Modells angewandt werden.