Neue CID-spaltbare Cross-Linker: Synthese, Fragmentierungsmechanismen und Anwendung zur Proteinstrukturanalyse

Die Funktion eines Proteins, z.B. eines Enzyms oder Ionenkanals, ist eng mit seiner dreidimensionalen Struktur bzw. der spezifischen Bindung an andere Moleküle verknüpft, so dass der Aufklärung von Tertiärstrukturen von Proteinen sowie der Strukturuntersuchung von Protein-Protein-Komplexen eine herausragende Bedeutung in den Life Sciences zukommt. Bei der Lösung dieser komplexen Fragestellungen zeigte sich, dass chemisches Cross-Linking kombiniert mit modernen Methoden der Massenspektrometrie, eine leistungsstarke Alternative zur (Kernresonanz)-Spektroskopie (NMR) oder zur Röntgenstrukturanalyse (RSA) darstellt. Die Strukturaufklärung von Proteinen mit NMR bzw. RSA liefert sehr genaue und aussagekräftige Strukturdaten, erfordert jedoch relativ hohe Mengen an gereinigtem Protein und ist überdies vergleichsweise zeitaufwendig. Chemisches Cross-Linking dagegen beruht auf der kovalenten und selektiven Verknüpfung einzelner Seitenkettenfunktionalitäten der Aminosäuren (z.B. Amino- oder Mercaptogruppen) mit entsprechenden Reagenzien, wodurch die Abstände der verbrückten Aminosäuren in Proteinen ermittelt werden können. Diese analytische Strategie liefert bei geringem Substanzverbrauch rasch Ergebnisse, ist automatisierbar und empfindlich, wodurch sich chemisches Cross-Linking insbesondere zur Analyse schwer kristallisierbarer oder schlecht isolierbarer Proteine anbietet (z.B. Membranproteine oder sehr große Proteine bzw. Proteinkomplexe). Für eine erfolgreiche Strukturaufklärung mit chemischem Cross-Linking ist allerdings die schwierige Analyse der komplexen Peptidgemische nach enzymatischer Spaltung der derivatisierten Proteine sicher zu gewährleisten. Daher sind maßgeschneiderte Cross-Linking-Reagenzien nötig, die entweder eine selektive Anreicherung gebildeter Cross-Linking-Produkte ermöglichen oder eine massenspektrometrische Detektion anhand spezifischer Eigenschaften, wie z.B. Isotopenmuster, charakteristischer Fragmentionen oder Neutralteilchenverluste in Tandem-massenspektrometrischen Experimenten, erlauben. In dem hier vorgestellten Projekt sollen neue Cross-Linking-Reagenzien entwickelt, synthetisiert und umfassend getestet werden. Die neuen Reagenzien fragmentieren aufgrund ihrer Struktur bei Kollisionsaktivierung (Collision-Induced Dissociation, CID) in Tandem-MS-Experimenten kontrolliert und vorhersehbar und erlauben so eine selektive und hochempfindliche Identifizierung von entsprechend derivatisierten Peptiden.