Analyse der Selbstinteraktion von Laminin

Das heterotrimere (α,β,γ-Untereinheiten), 800 kDa-große Glycoprotein Laminin ist der nicht-kollagene Hauptbestandteil der Basalmembranen, der zelluläre Aktivitäten wie Adhäsion, Migration, Differenzierung und Apoptose kontrolliert. Laminin ist essentiell für die Bildung der Basalmembranen durch Interaktionen mit sich selbst und anderen Basalmembran-Komponenten. Die N-terminalen Domänen von Laminin β1- und γ1-Ketten wurden exprimiert und für die Analyse der Laminin-Interaktion verwendet. Die vernetzten heterodimeren Komplexe wurden durch eindimensionale Gelelektrophorese oder Größenausschlusschromatographie isoliert und mit verschiedenen Proteasen gespalten. Die resultierenden Peptidgemische wurden mittels eines Nano-HPLC-Systems getrennt, das direkt an ein FTICR-Massenspektrometer mit Nano-ESI-Quelle gekoppelt war. Die exzellente Auflösung und Massengenauigkeit der FTICR-MS ist unabdingbare Voraussetzung für eine korrekte Identifizierung der Cross-Linking-Produkte, die durch die Verwendung stabil-isotopenmarkierter Cross-Linking-Reagenzien noch erhöht wird. Eine weitere Strategie besteht in der Anwendung biotinylierter Reagenzien, die eine Reinigung der Cross-Linking-Produkte mittels Affinitätschromatographie erlauben. Die erhaltenen Distanzbeschränkungen wurden verwendet, um Strukturmodelle der N-terminalen Laminindomänen mittels Rosetta zu erstellen und so weitere Einblicke in die Funktion der Laminine zu erhalten.