Charakterisierung des Lernproteoms von Drosophila durch zellselektive nicht-kanonische Aminosäuremarkierung

Die Bildung des Langzeitgedächtnisses ist ein von der Proteinsynthese abhängiger Prozess. Die Identität und Funktionalität des Proteoms, das während der LTM-Bildung neu synthetisiert wird, ist nicht gut verstanden. Unser Forschungsziel ist daher die Charakterisierung des Lernproteoms.

Die Beschreibung des Drosophila-Lernproteoms erfolgt mit Hilfe modernster Techniken, die von Dieterich und Kollegen entwickelt wurden. BONCAT (bio-orthogonal non-canonical amino acid tagging, Dieterich et al., 2006; Dieterich et al., 2007) und FUNCAT (fluorescent NCAT; Dieterich et al., 2010) verwenden künstliche azidhaltige Aminosäuren (AA), die in neu synthetisierte Proteine eingebaut werden und das natürliche AA Methionin ersetzen. Aufgrund ihrer Azidgruppe können sie über eine kupferkatalysierte 3+2-Azid-Alkin-Cycloaddition (Click-Chemie; Rostovtsev et al., 2002) mit einem Alkin-Affinitäts-Tag (BONCAT) oder mit einem Fluoreszenz-Tag (FUNCAT) markiert und anschließend massenspektrometrisch identifiziert (BONCAT) oder visualisiert (BONCAT & FUNCAT) werden.
Um Proteine ausschließlich in bestimmten Geweben zu markieren, haben wir außerdem GINCAT (genetically introduced NCAT) in Drosophila entwickelt (Erdmann et al., 2015). GINCAT verwendet das künstliche azidhaltige AA Azidonorleucin (ANL; Link et al., 2006; Tanrikulu et al., 2009). Die endogene Translationsmaschinerie kann den Einbau von ANL als Ersatz für Methionin in Proteine nicht realisieren, da die azidhaltige Seitenkette von ANL zu lang ist, um in die AA-Bindungstasche des Wildtyp-MetRS zu passen. Durch die Verwendung einer einzigen Aminosäuremutation (LeucintoGlycin) in der Methionin-Bindungstasche konnten wir erfolgreich MetRSLtoG-Konstrukte in das Drosophila-Genom einbauen, die den Einbau von ANL unter der Kontrolle der vorgeschalteten Aktivierungsstelle (UAS) ermöglichen. Die Erzeugung dieser transgenen Fliegen ermöglicht die gezielte Expression von MetRSLtoG und damit den ANL-Einbau in Proteine ausgewählter Gal4-gesteuerter Zelltypen in lebenden Drosophila nach Ereignissen wie Lernen und anschließender Visualisierung mit FUNCAT oder biochemischer Analyse und Massenspektrometrie mit BONCAT.

Characterization of the Drosophila Learning Proteome using Cell-Selective Non-Canonical Amino Acid Tagging

The formation of long-term memory is a protein synthesis-dependent process. The identity and functionality of the proteome that is newly synthesized during LTM formation is not well understood. Our research objective, therefore, is the characterization of the learning proteome.

We address the description of the Drosophila learning proteome with state of the art techniques developed by Dieterich and colleagues. BONCAT (bio-orthogonal non-canonical amino acid tagging, Dieterich et al., 2006; Dieterich et al., 2007) and FUNCAT (fluorescent NCAT; Dieterich et al., 2010) employ artificial azide-bearing amino acids (AA) that incorporate into newly synthesized protein surrogating the natural AA methionine. Due to their azide-group they can, via a copper-catalyzed 3+2 azide alkyne cycloaddition ( click chemistry ; Rostovtsev et al., 2002), be tagged with an alkyne-affinity tag (BONCAT) or with a fluorescent tag (FUNCAT) and subsequently identified using mass spectrometry (BONCAT) or visualized (BONCAT & FUNCAT).
Furthermore, in order to exclusively label proteins in specific tissues we developed GINCAT (genetically introduced NCAT) in Drosophila (Erdmann et al., 2015). GINCAT employs the artificial azide-bearing AA azidonorleucine (ANL; Link et al., 2006; Tanrikulu et al., 2009). The endogenous translation machinery cannot realize incorporation of ANL as a surrogate for methionine into proteins as ANL s azide-bearing side chain is too long to fit into the AA binding pocket of the wild type-MetRS. By using a single amino acid mutation (LeucintoGlycin) in the methionine binding pocket we were able to successfully incorporate MetRSLtoG constructs into the Drosophila genome that allow ANL incorporation under the control of the upstream activation site (UAS). The generation of these transgenic flies allows targeted expression of MetRSLtoG and, as a consequence, ANL-incorporation into proteins of selected Gal4-driven cell types in living Drosophila after events such as learning and subsequent visualization using FUNCAT or biochemical analysis and mass spectrometry using BONCAT.