Regulierung der Src-Kinase Lck durch posttranslationale Modifikation und TCR/Lck-Interaktionen

Die Src-Familienkinase (SFK) Lck ist für die T-Zell-Rezeptor (TCR)-vermittelte Signalübertragung von entscheidender Bedeutung. Die Aktivität von Lck wird durch Phosphorylierung der Tyrosinreste Y394 und Y505 reguliert, die auch die Konformation von Lck steuern. Mit Hilfe hochentwickelter FLIM/FRET-Messungen und biochemischer Analysen konnten wir zeigen, dass die de novo-Phosphorylierung von Lck-Y394 nach der TCR-Bindung zwingend erforderlich ist, um die T-Zell-Aktivierung einzuleiten. Darüber hinaus aktiviert konstitutiv aktives/offenes Lck (eine Y505F-Mutante) T-Zellen nur dann, wenn der TCR gleichzeitig durch Antigen aktiviert wird. Ein Hauptziel dieses Vorhabens ist es zu verstehen, wie der TCR und Lck zusammen die Aktivierung der membranständigen T-Zell-Signalgebung orchestrieren, indem neuartige biochemische, zelluläre und Mausmodelle verwendet werden.
Neben Y505 und Y394 verfügt Lck über weitere Aminosäuren, die an der Regulierung seiner Aktivität beteiligt sind. Die Funktion dieser Stellen für die TCR-vermittelte Signalübertragung und die T-Zell-Aktivierung ist jedoch nicht bekannt. Vor kurzem haben wir Knock-in-Mäuse erhalten, die Y192F- und Y192E-Mutanten von Lck exprimieren. Wir zeigen, dass die Y192E-Mutation die thymische Entwicklung von T-Zellen stark beeinträchtigt. Die eingehende Analyse der Y192E-Maus und die funktionelle/biochemische Charakterisierung von Lck-Y195E ist ein weiteres Ziel unseres Antrags. Wir haben auch gezeigt, dass konservierte Cysteine (insbesondere C476) eine Rolle bei der Regulierung von Lck spielen. Ein weiteres Ziel ist es daher, die funktionelle Rolle dieser Reste in T-Zellen zu untersuchen. Wir haben kürzlich eine Knock-in-Maus erhalten, die eine C476A-Mutante von Lck exprimiert, die wir während der 3^rd Förderperiode von CRC854 phänotypisch und funktionell charakterisieren werden. Insgesamt erwarten wir, dass unser Projekt ein neues Licht auf die seit langem bestehende Frage werfen wird, wie die Funktion von Lck durch posttranslationale Modifikationen reguliert wird. Wir glauben, dass ein tieferes molekulares Verständnis des Zusammenspiels von TCR und Lck, das zur ITAM-Phosphorylierung führt, neue Perspektiven für die Modulation der T-Zell-Aktivierung bei Autoimmunkrankheiten und/oder für die Konstruktion besserer chimärer Antigenrezeptoren (CARs) für die Krebsimmuntherapie eröffnen könnte.

Regulation of the Src-family kinase Lck by posttranslational modification and TCR/Lck interactions

The Src family kinase (SFK) Lck is crucial for T cell receptor (TCR)-mediated signaling. Lck’s activity is regulated via phosphorylation of tyrosine residues Y394 and Y505, which also regulate the conformation of Lck. Taking advantage of sophisticated FLIM/FRET measurements and biochemical analyses we have shown that de novo phosphorylation of Lck-Y394 upon TCR engagement is mandatory to induce T cell activation. Moreover, constitutively active/open Lck (a Y505F mutant) only activates T cells if the TCR is simultaneously engaged by antigen.  A major goal of this proposal is to understand how the TCR and Lck together orchestrate the activation of membrane proximal T cell signaling employing novel biochemical, cellular and mouse models.
Beyond Y505 and Y394, Lck possesses additional amino acids which are involved in the regulation of its activity. However, the function of these sites for TCR-mediated signaling and T cell activation is not understood. Recently we obtained knock-in mice expressing Y192F and Y192E mutants of Lck. We show that the Y192E mutation severely alters thymic development of T cells. The in depth analysis of the Y192E mouse and the functional/biochemical characterization of Lck-Y195E is an additional goal of our proposal. We have also shown that conserved cysteines (in particular C476) play a role in the regulation of Lck. A further goal is thus to investigate the functional role of these residues in T cells. We recently obtained a knock-in mouse expressing a C476A mutant Lck, which we will phenotypically and functionally characterize during the 3^rd funding period of CRC854. Altogether we expect that our project will shed new light into the long lasting question how the function of Lck is regulated by posttranslational modifications. We believe that a deeper molecular understanding of the TCR-Lck interplay leading to ITAM phosphorylation might open new perspectives to modulate T cell activation in auto-immune diseases and/or to construct better chimeric antigen receptors (CARs) for cancer immunotherapy.