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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Klasse B: prokaryotische Expression, in-vitro Renaturierung, Reinigung und biophysikalische Charakterisierung

Finanzierung:
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ;
Zu G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören eine Vielzahl von Peptidrezeptoren wie beispielsweise für Glukagon, Sekretin, Parathyroidhormon (PTH), Corticotropin-Releasing Hormon (CRH), Glucagon-like Peptide (GLP) sowie Calcitonin. Fehlfunktionen dieser Rezeptoren stehen im Zusammenhang mit dem Auftreten zahlreicher Stoffwechselkrankheiten wie Osteoporose, Mukoviszidose, Diabetes mellitus Typ 2 und Wachstumsstörungen, sowie verschiedener Erbkrankheiten. G-Protein gekoppelte Rezeptoren wie die Rezeptoren für Neuropeptid Y (NPY) sind wiederum für eine Anzahl anderer physiologischer Aktivitäten von Bedeutung. So spielen beispielsweise die Rezeptoren Y1 und Y5 für die Regulation der Nahrungsaufnahme eine Rolle, während dem Y2-Rezeptor eine Funktion bei pathologischen Ereignissen wie Epilepsie zugeschrieben wird. Somit stellen diese Rezeptoren attraktive Angriffspunkte für die Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen durch Entwicklung therapeutisch wirksamer Agonisten wie auch Antagonisten dar. Innerhalb des Projektes sollen drei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, der humane PTH-, GLP1- sowie der Y2-Rezeptor, in Escherichia coli (E. coli) in Form von inclusion bodies überexprimiert werden. Im Anschluss daran sollen geeignete Bedingungen für die Solubilisierung sowie die in vitro-Renaturierung und Reinigung entwickelt und die renaturierten Rezeptoren hinsichtlich ihrer nativen Strukturierung biophysikalisch charakterisiert werden. Zum Nachweis der funktionellen Integrität der rekonstituierten Rezeptoren soll zum einen die hochaffine Wechselwirkung mit den für diese Rezeptor-Klasse typischen Liganden untersucht werden. Die korrekte Faltung der natürlicherweise intrazellulären Bereiche soll durch Analyse der Wechselwirkungen mit konstitutiv aktiven Arrestin-Mutanten bestätigt werden. Die Funktionalität der rekonstitutierten Rezeptoren soll darüber hinaus mittels verschiedener spektroskopischer Techniken (Circulardichroismus, Fluoreszenz, Fluoreszenz-Polarisation und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) untersucht werden. Informationen zur Struktur der Rezeptoren bzw. der rezeptorgebundenen Liganden werden von NMR-Untersuchungen (solid/liquid state NMR) und, im Idealfall, von einer Röntgenstrukturanalyse der von uns im großen Maßstab erzeugten Rezeptoren erwartet.

Schlagworte

Arrestin-Mutanten, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), Peptidrezeptoren, in-vitro Renaturierung, inclusion bodies

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