Projekt 10: Maladaptation der Leberschranke bei alkoholbedingter Leberschädigung im Rahmen des GRK 2408: Maladaptive Prozesse an physiologischen Grenzflächen bei chronischen Erkrankungen

Die alkoholische Lebererkrankung (ALD) ist weltweit eine der häufigsten Ursachen für leberbedingte Morbidität und Mortalität und umfasst ein Spektrum von Leberschäden, das von einfacher Steatose über Steatohepatitis und Fibrose bis hin zur Zirrhose reicht. An der Pathogenese dieser multifaktoriellen Erkrankung sind sowohl nicht-parenchymale als auch parenchymale Zellen (Hepatozyten) der Leber beteiligt. Das Projekt konzentriert sich auf funktionelle Studien in einem Mausmodell und isolierte primäre Kupffer-Zellen (KCs), Lebersinusoidalendothelzellen (LSECs) und Hepatozyten von Mäusen, die chronisch mit einer alkoholhaltigen Lieber-DeCarli-Diät (Ethanol, EtOH) oder einer isokalorischen Kontrolldiät gefüttert wurden. Nach Auslösung des Frühstadiums der ALD werden im Mausmodell vergleichende Analysen durchgeführt, bei denen die Integrität der Leberschranke sowie die systemische und lokale Entzündung untersucht werden. Dabei werden Chemokine, Zytokine, DAMPs, Leukozytenaktivierung und hepatische Infiltration mittels Immunhistologie, Durchflusszytometrie und Organhistopathologie analysiert (Kooperation mit Projekt 7, Projekt 8 und Projekt 9 des GRK 2408). Weiterhin werden der Verlust von Fenestrae, Fibrogenese, Nekroptose, Apoptose, Pyroptose und oxidativer Burst sowie die Phagozytose durch KCs in verschiedenen Zelltypen untersucht. Darüber hinaus werden die NF-B-Aktivität und die zellulären Reaktionen (Zytokinfreisetzung, Zellüberleben) jedes isolierten primären Zelltyps (KCs, LSECs und Hepatozyten) untersucht (Zusammenarbeit mit Projekt 1 des GRK 2408). Die Zellen werden durch enzymatischen Aufschluss von Lebergewebe und Gradientenzentrifugation isoliert. Für die Isolierung der Zellen werden selektives Adhärenzverhalten (KCs) und anschließend F4/80 (KCs), CD45 und CD31 (LSECs) oder ASGPR (Hepatozyten) als Signaturmarker verwendet. Die NF-B-Signalübertragung wird durch eine Reihe von posttranskriptionellen Modifikationen (PTM) reguliert, darunter kovalent konjugiertes Ubiquitin. Deubiquitinylierende Enzyme (DUB) spalten Ubiquitin von Substratproteinen ab und sind somit wichtige Regulatoren des NF- B-Systems. Die DUBs A20 und OTUB1 regulieren bzw. beenden die TNF- bzw. IL-1ß-induzierte NF-B-Aktivierung und unterdrücken Entzündungen und oxidativen Stress, aber auch DNA-Reparatur und Zelltod. Um die Kausalität von DUBs zu bestimmen, werden ausgewählte DUBs ausgeschaltet (A20 und OTUB1) und die Folgen einer chronischen Exposition gegenüber EtOH oder einer Stimulation mit Endotoxin oder DAMPs auf die NF-B-Aktivität, die Zytokinfreisetzung, Inflammasom-Aktivierung und Zellüberleben (Immunoblots, ELISA, FACS) in isolierten Primärzellen (KCs, LSECs und Hepatozyten) und verschiedenen menschlichen Leberzelllinien (menschliche Kupffer-Zellen, HLSEC/ciJ LSECs, HepG2 und AML12 Hepatozyten etc.) (Zusammenarbeit mit Projekt 1 und Projekt 7 des GRK 2408).

Project 10: Maladaptation of the hepatic barrier in alcohol-induced liver injury within the RTG 2408: Maladaptive Prozesse an physiologischen Grenzflächen bei chronischen Erkrankungen

Alcoholic liver disease (ALD) as one of the predominant causes of liver-related morbidity and mortality worldwide encompasses a spectrum of liver injury ranging from simple steatosis to steatohepatitis, fibrosis, and finally cirrhosis. The pathogenesis of this multifactorial disease in-volves both hepatic non-parenchymal and parenchymal cells (hepatocytes). The project focus on functional studies in a murine model and isolated primary Kupffer cells (KCs), liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and hepatocytes from mice being chronically fed with a Lieber-DeCarli diet containing alcohol (ethanol, EtOH) or an isocaloric control diet. Following induction of the early stage of ALD, comparative analyses will be conducted in the murine model, scrutinizing hepatic barrier integrity and systemic and local inflammation. Herein chemokines, cytokines, DAMPs, leukocyte activation and hepatic infiltration via immunohistology, flow cytometry, organ histopathology will be analysed (cooperation with Project 7, Project 8 and Project 9 of the RTG 2408). Further, loss of fenestrae, fibrogenesis, necroptosis, apoptosis, pyroptosis, and oxidative burst as well as phagocytosis by KCs in different cell types will be investigated. In addition, the NF- B activity and cellular responses (cytokine release, cell survival) of each isolated primary cell type (KCs, LSECs and hepato-cytes) will be studied (cooperation with Project 1 of the RTG 2408). Cells will be isolated by enzymatic digestion of liver tissue and gradient centrifugation. For the isolation of cells selective adherence behaviour (KCs), and subsequent F4/80 (KCs), CD45 and CD31 (LSECs) or ASGPR (hepatocytes) will be used as signature expression markers. NF- B signaling is regulated by a variety of posttranscriptional modifications (PTMs), including covalent conjugated ubiquitin. Deubiquitinylating enzymes (DUB) cleave ubiquitin from substrate proteins and are hence key regulators of the NF- B sys-tem. DUBs A20 or OTUB1 regulate/terminate TNF- or IL-1ß-induced NF- B activation, respec-tively, suppressing inflammation and oxidative stress, but also DNA repair and cell death. To determine the causality of DUBs, selected DUBs will be knocked down (A20 and OTUB1) and the consequences of chronic exposure to EtOH, or stimulation with endotoxin or DAMPs on NF- B activity, cytokine release, inflammasome activation and cell survival (immunoblots, ELISA, FACS) will be evaluated in isolated primary cells (KCs, LSECs and hepatocytes) and different hepatic human cell lines (human Kupffer cells, HLSEC/ciJ LSECs, HepG2 and AML12 hepato-cytes etc.) (cooperation with Project 1 and Project 7 of the RTG 2408).